Глава 19
Итоги работы сотрудников лаборатории актиномицетов и актинофагов
Теперь мне хотелось бы, по возможности кратко, подвести итоги продолжавшихся почти четверть века исследований во время моей работы в лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов, а также вспомнить сотрудников, в то время работающих в нашей лаборатории.
Стремительно развивающаяся генетика и молекулярная биология бактерий уже продемонстрировала, какую важную роль играют бактериофаги (главным образом, умеренные) в изучении модельных бактериальных штаммов, таких, например, как E.coli, Salmonella thyphimurium и другие. При этом совершенно необходимым этапом являлось генетическое изучение самих бактериофагов, о котором уже были опубликованы большие обзоры и целые книги. Актинофаг phiC31 мог бы сыграть такую же важную роль в изучении актиномицетов, образующих большинство используемых в медицине и ветеринарии антибиотиков.
Как я уже упоминала, результаты по генетическому изучению актинофага phiC31 и первичному изучению его ДНК были подробно описаны в большом обзоре «Genetics and Molecular Biology of Streptomyces bacteriophages» («Генетика и молекулярная биология Streptomyces бактериофагов»), опубликованном в американском журнале Microbiological Reviews, June 1980, p. 206–229. Авторами обзора были Н. Д. Ломовская, К. Ф. Четер и Н. М. Мкртумян. В этот обзор вошли данные по генетическому изучению и физической характеристике генома актинофага phiC31, полученные в нашей лаборатории в период между 1968 и 1979 годами.
Первые данные по изоляции и изучению фага phiC31 были получены Норой Манвеловной Мкртумян, Натальей Львовной Гостимской и мной. Мы с Норой Манвеловной были первыми в нашей лаборатории и проработали вместе с 1968 по 1992 годы, вплоть до моего отъезда в Америку. В 70-ые годы она опубликовала не менее десятка работ, посвященных генетическому изучению актинофага phiC31. Нору в лаборатории все любили. Она создавала особый климат во взаимоотношениях между сотрудниками лаборатории. Кроме того, она была прекрасным профессиональным переводчиком с русского на английский, что было редкостью. Норины переводческие способности необычайно способствовали появлению наших статей в англоязычных журналах в Америке и Англии. Работать вместе с ней над ее переводами было одно удовольствие. Условием посылки статей за рубеж была их предварительная публикация сначала в отечественных журналах. Кроме того, статья должна была пройти через ряд экспертных комиссий как в институте, так и в министерстве. Поэтому публикация за рубежом требовала значительных усилий, и проходил большой срок от получения результатов до появления их в зарубежной печати. В какое-то время мы даже перестали посылать статьи за рубеж, и наши иностранные коллеги говорили с юмором, что собираются учить русский. Но не собрались.
Почти одновременно с Норой в лабораторию пришли Н. Л. (Наташа) Гостимская и чуть позже Лидия Константиновна (Лида) Емельянова, Татьяна Александровна (Таня) Чиненова, Татьяна Александровна (Таня) Воейкова – все молодые выпускники Московского университета, а также дипломник кафедры генетики МГУ. Валерий Николаевич (Валерий) Даниленко. С ними со всеми мы проработали в лаборатории долгие годы. Правда, в современном послужном списке В. Н. Даниленко это не упоминается.
Нашими первоочередными задачами по генетическому изучению фага phiC31 было получение количественных параметров инфекции чувствительных к актинофагу вариантов штамма Streptomyces coelicolor А(3)2 и индикаторного штамма S.lividans 66 в одноступенчатом цикле развития (ОЦР) фага, когда оценивается количество фаговых частиц, освобождающееся из каждой инфецированной клетки. Путь к получению количественных параметров процесса инфекции оказался достаточно тернистым.
Получение количественных оценок в опытах ОЦР является основой всех генетических эеспериментов. Эта задача осложнялась несинхронным прорастанием спор актиномицетов, что затрудняло определение стадии развития актиномицетного штамма, чувствительной к фаговой инфекции. После преодоления ряда методических трудностей актинофаг phiC31 был охарактеризован в количественном отношении как умеренный фаг, способный к лизису и лизогенизации. Были оценены число фаговых частиц, образующихся при лизисе одной инфецированной прорастающей споры, частота лизогенизации чувствительных штаммов, параметры спонтанного и индуцированного образования фага лизогенными культурами (журн. Генетика, 1971, том 7, стр. 108–112 и J. Virology, 1972, v. 9: 258–262). Авторами первой статьи были Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян, а второй – мы же и соавторы, Н. Л. Гостимская и В. Н. Даниленко. Представляется, что прежде такие параметры процесса инфекции и образования фага лизогенными культурами не были известны ни для одного из изучаемых актинофагов.
Наташей Гостимской и Таней Чинёновой в процессе получения и характеристики с-мутантов актинофага phiC31, не способных к поддержанию лизогенного состояния и образующих прозрачные бляшки в отличие от мутных, образуемых фагом дикого типа, были изолированы cts-мутанты, которые являлись с-мутантами только при высокой температуре. Лизогены, содержащие в качестве профага cts-мутант были использованы, в частности, как удобная модель для более точного определения стадии в развитии актиномицета, чувствительной к фаговой инфекции. Н. Л. Гостимской (теперь уже Н. Л. Новиковой) с соавторами О. Н. Капитоновой и Н. Д. Ломовской (ж. Микробиология, 1973, том 17, стр. 713–718) были осуществлены эксперименты по термоиндукции (краткая инкубация при высокой температуре) лизогенов, несущих в качестве профага cts-мутант, находящихся на разных стадиях развития. При этом происходило более синхронное образование фагового потомства, чем при инфекции фагом прорастающих спор. Эти эксперименты позволили показать, что продуктивная индукция фага у таких лизогенов происходит в спорах с короткими проростками. Эта же стадия оказалась чувствительной и к фаговой инфекции.
Параллельно с этими работами шла серьёзная подготовка к осуществлению экспериментов по определению локализации профага на генетической карте штамма S.coelicolor А(3)2, которая была осуществлена Лидой Емельяновой. К этому времени мы уже имели генетически маркированные штаммы S.coelicolor А(3) 2, присланные нам Д. А. Хопвудом. Предварительно Норой Мкртумян были получены мутантыфага, отличающиеся по частоте лизогенизации и по морфологии негативных колоний. В скрещиваниях были использованы лизогенные генетически маркированные штаммы, несущие в качестве профагов эти мутанты. В начале работы необходимо было освоить методы скрещивания актиномицетных штаммов, что потребовало больших усилий. Не вдаваясь в значительные трудности и даже ошибки на этом пути, сайт интеграции профага в хромосому актиномицета был локализован между двумя соседними генами uraA1 и pheA1, расположенными на генетической карте штамма S.coelicolor А(3) 2 (J. Gen. Microbiol., 1973, v. 77: 455–460). Статья опубликована в соавторстве Н. Д. Ломовской, Л. К. Емельяновой, Н. М. Мкртумян и С. И. Алиханяна). Было также продемонстрировано явление зиготной индукции при скрещивании лизогенных и нелизогенных штаммов актиномицетов (Генетика, 1973, 9:103–110, статья в соавторстве Н. Д. Ломовской и Л. К. Емельяновой).
Разработка методов получения количественных данных, характеризующих процесс инфекции актинофагом phiC31 чувствительного штамма S.lividans 66, позволяла приступить к подготовке экспериментов по построению генетической карты этого актинофага. Как правило, для картирования фаговых геномов получают большой набор условно-летальных мутантов, например, температурочувствительных мутантов (ts), которые образуются практически во всех генах, имеющихся в геноме фага. К нашему огорчению, сам фаг phiC31 оказался неспособен расти на высокой (37° С) температуре и сам был ts-мутантом.
Но довольно скоро удалось получить фаг, способный расти при 37° С. Он и явился объектом всех дальнейших исследований. Вся эта работа, включая и построение генетической карты актинофага phiC31, в основном, выпала на долю Тани Чиненовой. Оглядываясь назад, нельзя переоценить тот вклад, который она внесла в изучение генома phiC31, построение его генетической карты. Пришлось разрабатывать специальные приемы для получения данных по комплементации (отнесения мутантов к одному или разным генам) и рекомбинации (расположению мутантов на генетической карте фага) в несинхронизированной по выходу фага системе. Статья, в которой были представлены данные по построению первой генетической карты актинофага phiC31 была опубликована в 1975 году в журнале Генетика, том 11, стр. 132–141. Соавторами этой статьи были Т. А. Чиненова и Н. Д. Ломовская. Все ts-мутанты и другие различные по фенотипу мутанты, за исключением одного, были расположены в линейном порядке по одну сторону от с-мутанта.
Для дальнейшего генетического изучения структуры генома фага phiC31 необходимо было охарактеризовать его физически. Это было сделано Ириной Алексеевной Сладковой, нашей многолетней коллегой, физиком по образованию. В статье, опубликованной в журнале Генетика, т. 13, стр. 342–344, 1977 г. в соавторстве И. А. Сладковой, Н. Д. Ломовской и Т. А. Чиненовой, было показано, что геном актинофага phiC31, также как и геномы большого числа бактериофагов, представляет собой линейную молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая была детально охарактеризована и в двух последующих статьях И. А. Сладковой, опубликованных в журн. Молекулярная Биология, 1980, т. 14, стр. 1131–1136 и 1137–1141.
В конце 1970-х годов мы попытались изолировать дополнительно фаги, действующие на штаммы S.coelicolor А(3)2 и S.lividans 66, из имеющейся у нас большой коллекции родственных штаммов актиномицетов, т. к. после обнаружения фага phiC31 мы не предпринимали таких попыток. Два лизогенных штамма были обнаружены Таней Чиненовой. Анализ строения ДНК фагов, образуемых этими лизогенными штаммами, проводился И. А. Сладковой, а их фенотипические и генетические признаки вместе с Таней изучали Лиля Васильченко, Нора Мкртумян, а впоследствии и Ольга Клочкова. Оба обнаруженные фага phiC62 и phiC43 по данным гетеро-дуплексного анализа оказались практически гомологичными фагу phiC31. Фаг phiC31 отличался от фага phiC62 только наличием небольшой делеции. Фаг phiC62 был идентичен фагу phiC31 и по всем проверенным фенотипическим признакам. А вот изучение фага phiC43 принесло нам много интересных фактов. Этот фаг тоже был практически гомологичен фагу phiC31, но имел в отличие от него чужеродную вставку в несущественной для литического развития фага области генома, которая была обнаружена с помощью гетеродуплексного анализа.
Образованные в результате спонтанной индукции лизогенного штамма мутные негативные колонии phiC43 имели разную морфологию. Этот признак, как оказалось, отражал наличие у этих вариантов фага различий в структуре их ДНК. Кроме того, практически все они обладали важным фенотипическим признаком – отсутствием способности к лизогенизации чувствительных штаммов. Так мы впервые столкнулись с появлением актинофаговых мутантов, не способных к интеграции в хромосому актиномицета.
Оказалось, что чужеродная вставка включалась в фаговый ген, контролирующий синтез фермента интегразы. (ж. Генетика, 1979, стр. 1953-62. Соавторы статьи И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян). Конечно, мы сразу стали изучать возможность появления делеционных мутантов, образующихся в результате утраты фрагментов фагового генома среди вариантов фага phiC31, изолированных после обработки фага хелатирующими агентами, в том числе, и не способных к поддержанию и к установлению лизогенного состояния. Получение и характеристика большого набора делеционных мутантов фага phiC31, в том числе не способных к поддержанию лизогенного состояния с-мутантов и к установлению лизогенного состояния lyg-мутантов, стало настоящим подарком наших генетиков И. А. Сладковой, блестящему специалисту в области гетеродуплексного анализа ДНК. Первые полученные результаты по локализации делеционных мутантов на физической карте ДНК актинофага phiC31 были опубликованы в журн. Молекулярная Биология, 1980, том 14 стр. 918–915 и 916–921. Соавторами первой статьи были И. А. Сладкова, Л. Г. Васильченко, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян, а второй – И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова. Л. Г. Васильченко, Л. Б. Пельтс и Н. Д. Ломовская. Каким же урожайным на публикации статей по физическому и генетическому изучению фага phiC31 оказался 1980 год! Нашими генетиками в дальнейшем было получено и изучено генетически большое число делеционных мутантов актинофага phiC31, различающихся по фенотипам. Представители делеционных мутантов различного фенотипа были локализованы на генетической карте актинофага phiC31 (журн. Генетика, 1981, том 17, стр. 1967–1974, статья в соавторстве Л. Г. Васильченко, Н. М. Мкртумян и Н. Д. Ломовской). Это позволило установить соответствие генетических и физических карт этого актинофага и расположить на физической карте не только делеционные мутанты, но и температурочувствительные и другие мутанты этого фага.
Гетеродуплексный анализ ряда делеционных мутантов фага позволил идентифицировать в геноме фага непрерывную, значительную по длине область фагового генома, не существенную для его литического развития. В этой области среди делеций были локализованы на молекуле ДНК и мутанты в гене, контролирующем синтез фермента интегразы. Идентификация такой несущественной для литического развития фага области его генома открывала большие возможности для конструирования на его основе фаговых векторов, в которых эта область могла быть замещена актиномицетными или другими генами. Неоспоримым преимуществом таких фаговых векторов перед векторами, полученными, например, на основе плазмидных геномов, являлось то, что гибридный фаг, полученный в модельной системе в результате трансфекции гибридной фаговой ДНК штамма S.lividans 66, мог с помощью простой инфекции доставлять чужеродные гены в другие штаммы актиномицетов для осуществления разнообразных задач, таких, например, как идентификация генов антибиотикообразования в штаммах-продуцентах, получения мутаций в этих генах, замены одних генов на другие в геноме актиномицетов и т. д.
Итак, представляется, что в Москве были заложены фундаментальные основы для использования актинофага phiC31 в качестве объекта генной инженерии и конструирования на его основе фаговых векторов. Повторюсь, что начиная с 1977 года была выпущена серия работ по подробной характеристике молекулы ДНК фага phiC31, составляющей его геном. Кроме того, впервые для получения делеционных мутантов была использована обработка фага phi31 хелатирующими агентами. Полученные делеционные мутанты были подробно охарактеризованы и локализованы на физической и генетической картах актинофага phiC31, что позволило установить соответствие физической и генетической карт актинофага phiC31. Изучение фага phiC43, гомологичного фагу phiC31, несущего в составе своего генома чужеродную вставку, позволило сделать выводы о максимальной длине молекулы ДНК, которая может быть упакована в фаговую оболочку. Кроме того, в геноме актинофага phiC31 была идентифицирована значительная по длине непрерывная область, не существенная для литического развития актинофага, которую можно было замещать клонированными генами.
В конце 70-х годов актиномицеты прочно завоёвывают свои позиции в качестве объектов генной инженерии в отделе Д. Хопвуда. Первой ласточкой оказалась работа по успешной трансформации плазмидной ДНК штамма S.lividans 66. Этот штамм был послан нами Д. А. Хопвуду в далеком 1970 году вместе с фагом phCi31 в качестве уникального чувствительного к этому фагу индикаторного штамма. В результате этот штамм оказался самым удобным реципиентным штаммом для введения в него изолированной плазмидной ДНК.
Прошло ровно десять лет с тех пор, как актинофаг phiC31 был послан нами в отдел Д. Хопвуда. Имея в своем распоряжении наш богатый багаж генетического и физического изучения генома актинофага phiC31, Кит Четер, наконец, выбрал в качестве основы для конструирования фаговых векторных молекул актинофаг phiC31.
Настоящим прорывом в решении задачи конструирования и использования фаговых векторов на основе фага phiC31 стала демонстрация трансфекции протопластов штамма S.lividans 66 с помощью изолированной ДНК этого актинофага. Это позволяло манипулировать с молекулой фаговой ДНК, а после трансфекции отбирать нужные жизнеспособные фаги, несущие в своем геноме чужеродные клонированные фрагменты. Эта работа была опубликована Д. Зуаресом и К. Четером в том же продуктивном на статьи по фагу phi31 1980 году (Zuares J. E. and Chater K. F., J. Bacteriol. v. 142: 8-14). После этого Кит Четер и его коллеги семимильными шагами начали конструировать фаговые векторы различного назначения на основе актинофага phiC31. Мы от этого тоже имели большие преимущества, так как Кит Четер присылал нам все свои фаговые конструкции в течение последующих лет.
Помимо работ по генетическому изучению фага phiC31 как такового, в лаборатории интенсивно проводилось изучение взаимоотношений фага phiC31 и других актинофагов с актиномицетами. Ведущая роль тут принадлежала Тане Воейковой, которой, наряду с большой экспериментальной нагрузкой, вместе с Норой Мктрумян удавалось помогать мне руководить большой лабораторией. После моего отъезда из России руководство лабораторией перешло к Тане Воейковой, и я думаю, что подготовила себе неплохую замену, если эта лаборатория существует и по сей день, пройдя все сложности и перипетии постсоветского существования науки в России. (Нужно иметь ввиду, что я кончила писать эти мемуары уже довольно давно, в 1913 году.) Я про себя всегда считала Таню Воейкову везучим научным сотрудником. Ей, на первый взгляд, легко удавались сложные эксперименты. При этом она уделяла большое внимание своей семье, каждый год вся семья проводила отпуск в походах со сложными туристскими маршрутами.
Таня начала с освоения скрещиваний между производными А(3)2 различной фертильности, потом разрабатывала методы получения межвидовых гибридов. Особенно продуктивной оказалось работа по получению отдаленных гибридов между штаммами S.coelicolor А(3)2 и S.griseus Kr.15-продуцентом антибиотика стрептотрицина (в общем употреблении «гризина») и изучению их свойств в отношении их чувствительности к фагам phiC31 и Pg81, действующим только на один из родительских штаммов. После завершения этой работы нам представлялось, что при необходимости мы можем получать гибриды между всеми штаммами актиномицетов рода Streptomyces, которые пожелаем скрестить, хотя эта работа требовала большой сноровки и специальных знаний. Получение гибридов, в частности, расширяло возможности изучения их взаимодействия с актинофагами, т. к. можно было, например, в данном случае, получать гибриды, образующие антибиотик гризин и устойчивые к фагам, лизирующими этот продуцент при промышленном производстве гризина. Статья, описывающая получение и свойства таких отдаленных гибридов была опубликована в журнале Генетика, 1976, том 12, стр. 106–113, а в 1977 г. в журнале Journal of General Microbiology, v. 98: 187–198. Соавторами в ней были Ломовская, Н. Д., Воейкова, Т. А. и Мкртумян, Н. М.
В конце 70-х Таней Воейковой, Леной Славинской и Андреем Ореховым был начат цикл работ по идентификации у актиномицетов систем рестрикции и модификации с помощью актинофагов. Мне представлялось, что мы имели приоритет в этом направлении исследований, однако, в 1977 году мы опубликовали только тезисы на эту тему, а в 1978 году вышли одновременно наша статья по идентификации систем рестрикции и модификации у актиномицетов с помощью актинофагов и статья К. Четера с соавторами, описывающая выделение рестриктазы из штамма Streptomyces albus.
Вернусь еще к одному аспекту изучения имеющейся у нас коллекции актиномицетов, которая была проверена на устойчивость к большому числу антибиотиков (соавторы В. Н. Даниленко, Г. Г. Пузынина. Н. Д. Ломовская). Работы были опубликованы только на русском языке. Было продемонстрировано, что каждый штамм из коллекции обладал множественной устойчивостью к большому числу антибиотиков. Порывшись сейчас в интернете, обнаружилось, что такой вывод был впервые высказан в этих работах. Кроме того, в полученных результатах нас привлекло то, что каждый штамм коллекции, без исключения, имел свою индивидуальную характеристику в отношении признаков чувствительности и устойчивости к антибиотикам по аналогии с неповторимыми отпечатками пальцев у человека. Помню, что в этих статьях были также представлены интересные статистические данные.
В 70-ые и все последующие годы нас также интересовали проблемы генетической нестабильности многих признаков актиномицетов. Мы понимали, что дальше изучения генетических феноменов мы в то время еще двигаться не могли, но все же начали работы по картированию генетически нестабильных признаков на хромосоме штамма S.coelicolo-rA(3)2.
Молодожены Оля и Миша Фонштейны на выходе из родильного дома с крошкой Анной на руках у отца.
Такая спокойная милая наша девочка Анечка Ломовская, доченька Оли и Миши. Тут уж мы с Лёней подсуетились и Анечка стала Анной Ломовской как и пять прелыдущих поколений по женской линии в нашей семье.
Анечка Ломовская – взрослеем!