Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов

Рис. 4. Зависимость площади поверхности S от диаметра эритроцитов /D/ в норме /ᴏᴏᴏᴏ/ и при НС /ххххх/.

Анализ эритроцитов по коэффициентам, характеризующим форму показал, что форма эритроцитов закономерно изменяется: с уменьшением диаметра наблюдается увеличение прогиба центральной части клеток, характеризующейся коэффициентом Кϕ, изменяется форма периферической части, которая оценивается по коэффициенту Кэл. и происходит сдвиг к центру клетки точки, в которой толщина эритроцита максимальна, уменьшается отношение С/R. При уменьшении диаметров эритроцитов от 9,40 мкм до 6,75 мкм величина, Кϕ увеличивается от 0,14 до 0,35, величина Кэл. увеличивается от 0,6 до 1,7, а отношение С/R уменьшается от 0,72 до 0,55 (Рис.5,А,Б,В)

Масса и концентрация гемоглобина в эритроцитах также изменяется в зависимости от диаметров эритроцитов и имеет одну и ту же закономерность как для нормы, так и для НС: с уменьшением диаметров эритроцитов наблюдается уменьшение их массы и увеличение концентрации гемоглобина в клетках (Рис. 5, Г, Д).

Рис. 5. А,Б,В – Зависимость параметров формы (Кэл, Кϕ, С/R); Г, Д – массы (m) и концентрации гемоглобина (Cv) от диаметров (радиусов) эритроцитов (D, R ) в норме (++++++) и при наследственном сфероцитозе (........) Пояснения в тексте.

Теоретический анализ количественных экспериментальных данных показал, что изменения площади поверхности, объема, массы и концентрации гемоглобина, наблюдаемые при уменьшении диаметров эритроцитов по-видимому, могут быт., объяснены с помощью учета последствий отщепления от поверхности эритроцитов микропузырьков определенного размера. С помощью расчётов установлено, что для изменения площади поверхности, объема, массы гемоглобина и его концентрации в эритроците со средними параметрами в норме до состояния со средними параметрами при наследственном сфероцитозе потребуется порядка 20 отщеплений микропузырьков со средним радиусом Rj =0,34 мкм. При этом сохраняются все количественные соотношения параметров эритроцитов, полученные в эксперименте. Теоретический анализ показал, что в отщепляющихся микропузырьках может находиться гемоглобин в концентрациях, меньших, чем в исходной клетке, при этом после каждого отщепления объемная концентрация гемоглобина ( Cv в %) в эритроците возрастает.

Сравнение результатов анализа эритроцитов методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии с литературными данными показало, что величина среднего диаметра эритроцитов (8,20 мкм) соответствует данным, полученным при измерениях эритроцитов в плазме. Измеренные новым методом средние величины площади поверхности и объема эритроцитов несколько ниже данных, имеющихся в литературе. Это объясняется тем, что при измерениях площади поверхности и объема эритроцитов традиционными методами не учитываются особенности формы эритроцита, а их форма экстраполируется в общем случае к форме цилиндра (Тодоров И., 1961, Мосягина Е.Н., 1969). Данные о средних величинах массы и концентрации гемоглобина в эритроцитах хорошо согласуются с результатами, полученными при измерениях этих параметров другими методами (Козинец Г.И., соавт., 1978).

Имеющиеся в литературе сведения о полимодальной структуре распределения эритроцитов человека по диаметру в норме (Вергунова 3.И., 1979), подтверждены в данной работе для эритроцитов в норме и патологии.

Количественная оценка изменений формы, площади поверхности эритроцитов, массы и концентрации гемоглобина в клетках дополняет имеющиеся в литературе сообщения об изменениях, происходящих с эритроцитами в процессе старения. Показано, что при старении эритроцитов наблюдается уменьшение его диаметра (Бриллиант М.Д. ‚1979), изменение формы клеток (Gonsoni е.a.,1976), возрастание концентрации гемоглобина (Seaman е.а., 1977).

Известные данные о решающей роли фрагментации поверхности эритроцита в процессах старения (Рябов б.И., 1971) дают основания для проведения теоретического анализа влияния процесса отщепления микропузырьков от поверхности эритроцитов на изменение его свойств. Результаты теоретических расчётов согласуются с экспериментальными данными, что может служить еще одним подтверждением в пользу представлений о роли фрагментации поверхности эритроцитов в процессе их жизнедеятельности. Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование единого механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование данного механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

3. Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов in vitro

В этой серии экспериментов исследовались эритроциты в норме и эритроциты детей больных наследственным микросфероцитозом (НС). Для облегчения расчётов и единообразия получения результатов анализ эритроцитов, помещенных в аутоплазму, проводился при условиях, когда клетки находились в виде "монетных столбиков", при этом истинных микросфер при НС не наблюдалось.

Рис. 6. Кинограмма интерференционных картин эритроцитов в отраженном лазерном свете. Время между кадрами 1 сек. (Движение внутри эритроцитов наблюдается по смещению интерференционных полос).

При разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:1 и 1:5 в условиях изотонии как в норме, так и при НС, наблюдался распад "монетных столбиков" на отдельные клетки нормальной формы (двояковогнутый диск). Дальнейшее разведение аутоплазмы 0,9% раствором NaCl (1:2 и 1:8) приводило к появлению эритроцитов с выступами по краям и отдельными неровностями на поверхности. При разведении аутоплазмы (1:1О и более) происходило увеличение неоднородности поверхности эритроцитов, изменение их формы до эллипсоидальной и далее осуществлялся переход эритроцитов в сферическую форму. С помощью микрокиносъемки в отраженном лазерном свете было показано наличие интенсивного внутриклеточного движения в эритроцитах, находящихся в переходном от диска к сфере состоянии. (Рис. 6). Анализ размеров исходной формы двояковогнутого диска и конечной (сферической) показал, что изменение формы клеток сопровождается уменьшением их диаметра и площади поверхности в норме и при НС (Р<0,01), а объем при этом достоверно не изменяется.

Уменьшение общей площади поверхности эритроцитов, отмечаемое по данным интерферометрии, объясняется, по-видимому, тем, что сферуляция сопровождается образованием микровыростов, малые размеры которых не могут быть количественно учтены данным методом. Нами наблюдалось два типа сфероцитов: шиповидные с выростами на поверхности и игольчатые, с исчерченной поверхностью, без выростов.